Thèse Thérapie Génique par Édition de Base des Porphyries Érythropoïétiques H/F - 33

Établissement : Université de Bordeaux
École doctorale : Sciences de la Vie et de la Santé
Laboratoire de recherche : BoRdeaux Institute of onCology
Direction de la thèse : Jean-Marc BLOUIN ORCID 0000000190129411
Début de la thèse : 2026-10-01
Date limite de candidature : 2026-05-20T23:59:59

Les porphyries érythropoïétiques sont des maladies génétiques rares causées par un défaut de la biosynthèse de l'hème, entraînant une accumulation de porphyrines phototoxiques responsables principalement d'une photosensibilité cutanée sévère. La protoporphyrie érythropoïétique (PPE) et la porphyrie érythropoïétique congénitale (PEC) sont dues respectivement à un déficit en ferrochélatase (FECH) et en uroporphyrinogène III synthase (UROS). Les options thérapeutiques actuelles sont essentiellement symptomatiques. La greffe de cellules souches hématopoïétiques (CSH) constitue le seul traitement curatif mais son recours est limité par des risques importants, justifiant le développement de nouvelles approches thérapeutiques.
Sur le plan génétique, la PPE et la PEC sont des maladies autosomiques récessives. La PEC est associée à de nombreux variants pathogènes du gène UROS, dont le variant c.217T>C (p.C73R) retrouvé chez environ 35 % des patients. La PPE est très majoritairement liée à la co-ségrégation d'un variant délétère du gène FECH avec un allèle hypomorphe fréquent dans la population (IVS3-48T>C), responsable d'un défaut d'épissage et d'une dégradation de l'ARNm par le mécanisme de NMD. Ces variants représentent des cibles privilégiées pour une stratégie de correction génétique applicable à la majorité des patients concernés.
L'objectif de ce projet de thèse est de développer une thérapie génique innovante reposant sur l'édition de base afin de corriger spécifiquement ces mutations dans les cellules souches hématopoïétiques. L'édition de base permet une modification ciblée d'une seule base nucléotidique sans induire de cassures double brin de l'ADN, offrant ainsi un profil de sécurité particulièrement adapté à une application clinique.
Le projet s'articulera en trois axes. Le premier consistera à valider in vitro l'efficacité et la précision de l'édition de base à l'aide d'éditeurs de cytosine (CBE) fusionnés à la nucléase Cas-SpRY, permettant le ciblage de régions génomiques sans contrainte de PAM. Ces outils seront évalués dans des fibroblastes de patients PPE et PEC au niveau génomique, transcriptionnel et fonctionnel. En parallèle, des particules pseudo-virales (VLP) seront développées afin de délivrer transitoirement les complexes d'édition de base sous forme ribonucléoprotéique. Le deuxième axe visera à établir une stratégie de correction ex vivo des CSH, en comparant différentes méthodes de délivrance (électroporation d'ARNm/ARN guides versus VLP), puis à évaluer l'efficacité et la sécurité de l'édition dans un modèle murin humanisé de la PPE. Enfin, le troisième axe explorera une approche de thérapie génique in vivo en développant des VLP spécifiquement ciblées vers les CSH grâce à une glycoprotéine dérivée du virus Sindbis fusionnée à un fragment d'anticorps scFv dirigé contre CD117. Cette stratégie vise une correction ciblée, peu invasive et potentiellement transposable en clinique.
Ce projet ambitionne de poser les bases d'une thérapie génique de nouvelle génération pour les porphyries érythropoïétiques, avec un fort potentiel de transposition clinique.

L'hème est synthétisé par une série de huit réactions enzymatiques, dont le déficit entraîne une accumulation délétère de porphyrines responsable de maladies héréditaires appelées porphyries. Les porphyries sont classées en porphyries hépatiques ou érythropoïétiques selon le principal site de production des porphyrines et les patients atteints de porphyrie présentent divers symptômes, notamment une photosensibilité cutanée, des manifestations neurologiques et une hémolyse chronique. Notre laboratoire étudie depuis longtemps les porphyries érythropoïétiques (PE), notamment la protoporphyrie érythropoïétique (PPE ; OMIM 177000) et la porphyrie érythropoïétique congénitale (PEC ; OMIM 263700). La PPE et la PEC sont dues respectivement à déficit enzymatique en ferrochélatase (FECH, EC 4.99.1.1) et en uroporphyrinogène III synthase (UROS, EC 4.2.1.75), entraînant une surproduction de porphyrines photoréactives et plus précisément de la protoporphyrine IX (PPIX) pour la PPE, et de l'uroporphyrine I (UROI) et de la coproporphyrine I (COPROI) pour la PEC. Les porphyrines sont des composés hautement photoréactifs qui s'accumulent dans les érythrocytes, le foie, la rate et la peau. Elles induisent une photosensibilité cutanée après exposition au soleil dans les deux pathologies. L'accumulation des porphyrines varie considérablement d'un patient à l'autre et module la sévérité de la photosensibilité cutanée et des autres symptômes spécifiques à la PPE et la PEC. Environ 5% des patients atteints de PPE déclarent une hépatite métabolique cholestatique pouvant entraîner une insuffisance hépatique sévère car la PPIX est éliminée par voie biliaire. L'atteinte hépatique n'existe pas dans la PEC car l'UROI et la COPROI sont éliminées par voie urinaire mais on retrouve une anémie hémolytique chronique chez les patients atteints de forme sévères de la pathologie. Les traitements classiques pour la PPE et la PEC sont uniquement symptomatiques et insatisfaisants. La greffe allogénique de moelle osseuse est le seul traitement curatif. Cependant elle reste limitée par la disponibilité des donneurs HLA compatibles et comporte un risque important de morbidité et de mortalité. La greffe de CSH est donc réservée aux enfants atteints de forme sévères de PEC et aux patients PPE présentant des complications hépatiques sévères ou pour prévenir la survenue de nouvelles lésions après une transplantation hépatique.
La PPE et la PEC sont des maladies rares de transmission autosomique récessive. La PPE a une prévalence d'environ 1 cas pour 100 000 personnes et une incidence de 0,12 nouveau cas par million de personnes. La PEC est une pathologie plus rare avec une prévalence d'environ 1 cas pour 1 000 000 de personnes. D'un point de vue moléculaire, on retrouve 63 variants pathogènes du gène UROS répertoriés dans la Human Gene Mutation Database (HGMD). La majorité des variants sont des variants faux-sens et parmi ceux-ci, le variant c.217T>C (p.C73R) est retrouvé chez environ 35% des patients atteints de porphyrie érythropoïétique congénitale (CEP). La PPE est caractérisée par la co-ségrégation chez 95% des patients d'un variant délétère du gène FECH avec un allèle hypomorphe commun du gène FECH (IVS348T>C) responsable d'un défaut d'épissage. Le variant FECH c.315-48T>C a une prévalence de 10 % dans la population caucasienne et d'environ 50 % dans les pays d'Asie de l'Est. Cette substitution intronique favorise l'utilisation d'un site cryptique d'épissage aboutissant dans l'ARNm mature à la rétention aberrante d'un segment de 63 pb contenant un codon stop prématuré et à sa dégradation par le mécanisme nonsense-mediated decay (NMD). Ce variant bien caractérisé constitue une cible thérapeutique unique pour presque tous les patients atteints de PPE.
Ce projet de thèse vise à développer une thérapie génique innovante par édition de base adaptée à la majorité des patients atteints de PPE et de PEC en corrigeant l'allèle hypomorphe IVS3-48T>C du gène FECH pour la PPE et le variant c.217T>C (p.C73R) du gène UROS pour la PEC.
Ce projet sera réalisé en plusieurs étapes :
-Validation in vitro de l'efficacité de l'édition de base
-Développement d'une stratégie de thérapie génique par correction ex-vivo des CSH
-Développement d'une stratégie de thérapie génique in-vivo des CSH

Nous souhaitons développer pour les porphyries érythropoïétiques de nouveaux protocoles de thérapie génique par édition de base adaptés à la majorité des patients et avec un potentiel de translation clinique élevé. Ce projet sera structuré en 3 objectifs : valider in vitro l'efficacité et la précision de l'édition de base, développer une stratégie de correction ex vivo des cellules souches hématopoïétiques et explorer une approche de thérapie génique in vivo.

Nous utiliserons dans ce projet la stratégie d'édition de base car elle permet de modifier de manière ciblée une seule base nucléotidique, sans apporter d'ADN donneur exogène, sans induire de cassures double brin dans l'ADN et sans dépendre de la recombinaison homologue dirigée. De plus l'édition de base dans les CSH a montré son efficacité pour corriger de façon durable des pathologies comme la drépanocytose et la bêta-thalassémie. Deux classes principales d'éditeurs de bases ont été développées à ce jour : les adénine BE (ABE) et les cytosine BE (CBE) qui catalysent la conversion des paires de bases C-G en paires de bases T-A que nous utiliserons pour réaliser la correction génique de l'allèle hypomorphe (IVS348T>C) du gène FECH et du variant c.217T>C (p.C73R) du gène UROS.
-Validation in vitro de l'efficacité de l'édition de base
Nous utiliserons la nucléase SpRY qui permet de cibler n'importe quelle séquence génomique sans contrainte de PAM (Protospacer Adjacent Motif), car les loci génomique que nous devons cibler dans les gènes FECH et UROS ne contiennent pas de PAM NGG. Grâce à une collaboration avec la plateforme Crisp'Edit nous disposons sous forme de plasmides et d'ARNm de deux CBE différentes en fusion avec la CasSpRY, les systèmes SpRY-TadCBE et SpRY-CBE4Max. Les ARNm ou les plasmides seront transfectées dans des fibroblastes immortalisés de patients PPE porteurs de l'allèle hypomorphe et de patients PEC porteurs du variant c.217T>C (p.C73R). En plus des deux CBE, nous testerons sur ces modèles cellulaires différents ARN guides afin d'optimiser le ciblage et l'efficacité de l'édition de base. Ces données seront évaluées au niveau génomique par séquençage des gène FECH et UROS, l'expression de l'allèle hypomorphe sera quantifiée par RT-PCR et l'impact phénotypique de la correction génique sera mesurée directement grâce à l'accumulation de porphyrines dans des fibroblastes normaux et les fibroblastes de patients PPE et PEC (cytométrie de flux + dosage des porphyrines).
Afin d'améliorer la sécurité d'utilisation par rapport aux systèmes d'expression basés sur des plasmides et des virus nous développerons en parallèle une approche reposant sur l'utilisation de particules pseudo virales ou VLP (Virus Like Particle). Les VLP sont des particules virales non infectieuses capables de délivrer les systèmes d'édition de base sous forme de complexes ribonucléoprotéiques. Nous générerons des VLP-CBE pseudotypées avec la protéine VSV-G qui présente une bonne efficacité de transduction et un large tropisme cellulaire. L'efficacité des VLP-CBE pour l'édition de base dans les fibroblastes dérivés de patients PPE et PEC sera évaluée comme précédemment.

-Développement d'une stratégie de thérapie génique par correction ex-vivo des CSH
L'édition de base ex vivo dans les CSH est généralement réalisée soit par électroporation de la ribonucléoprotéine soit par électroporation de l'ARNm du système d'édition de base et de l'ARN guide. Pour cette stratégie ex vivo nous utiliserons la méthode présentant le meilleur rapport entre efficacité et sécurité entre l'électroporation de l'ARNm et de l'ARN guide et la transduction des cellules par des VLP-CBE. Ces deux méthodes seront testées sur des CSH de patients PPE et nous évaluerons leur efficacité pour corriger la mutation dans le lignage érythroïde
Pour évaluer la faisabilité et la sécurité de la thérapie génique par base editing de la PPE, nous souhaitons utiliser le modèle murin de PPE possédant un gène FECH humanisé porteur du polymorphisme c.315-48T>C 19. Ce modèle a été produit par l'équipe d'Elisabeth Minder en Suisse et le laboratoire souhaite engager une collaboration avec cette équipe de recherche.

-Développement d'une stratégie de thérapie génique in-vivo des CSH
Récemment une équipe a réussi à modifier des CSH in vivo en utilisant des ARNm encapsulés dans des nanoparticules lipidiques (LNP) ciblant le récepteur CD117 un marqueur de surface bien établi des CSH. Nous souhaitons dans ce projet modifier le ciblage cellulaire des VLP-CBE en modifiant les glycoprotéines d'enveloppe utilisées pour leur production. Afin d'établir une thérapie génique in vivo cliniquement réalisable et peu invasive nous souhaitons utiliser des VLP-CBE pseudotypées avec une glycoprotéine dérivée du virus Sindbis, modifiée et fusionnée à un fragment d'anticorps à chaîne unique (scFv) dirigé contre CD117. Cette conception permettra un ciblage des CSH par l'antigène, autorisant les VLP-CBE anti-CD117 administrées par voie systémique à transduire spécifiquement les CSH tout en minimisant les transductions hors cible.
Après avoir vérifié in vitro la sélectivité de la transduction des CSH par les VLP-CBE anti-CD117, nous utiliserons le modèle murin de PPE décrit au-dessus pour tester la spécificité de transduction et l'efficacité de l'édition de base dans les CSH in vivo.