Thèse Caractérisation Dynamique et Multiparamétrique de l'Activité des Canaux Ioniques Intracellulaires par Sondes Bret H/F - 33

Établissement : Université de Bordeaux
École doctorale : Sciences de la Vie et de la Santé
Laboratoire de recherche : Laboratoire de l'Intégration du Matériau au Système
Direction de la thèse : Yann PERCHERANCIER ORCID 0000000224105806
Début de la thèse : 2026-10-01
Date limite de candidature : 2026-05-20T23:59:59

Le criblage de nouveaux médicaments ciblant les canaux ioniques reste une activité complexe car les techniques de référence utilisées en criblage industriel (patch-clamp et sondes fluorescentes) ne donnent accès à l'activité d'un canal que de manière indirecte : on ne mesure pas directement l'activité du canal mais la variation de potentiel membranaire, le passage d'un ion ou le courant ionique entre l'extérieur et l'intérieur de la cellule, ce qui génère des biais expérimentaux. Les sondes à cations sont ainsi souvent utilisées lors d'un crible primaire mais engendrent un nombre important de faux positifs. Le patch-clamp, qui est la technique de référence, tend à être automatisé mais reste extrêmement coûteux et n'est réellement adapté qu'à un criblage à moyen débit.
Nous avons montré, en prenant comme modèle d'étude le canal TRPV1, que des sondes basées sur la technique du Transfert d'Énergie en Résonance de Bioluminescence (BRET) permettent de mesurer en temps réel et sur cellules vivantes plusieurs évènements moléculaires directement liés à l'activité du canal étudié, comme les interactions protéine-protéine engagées par les canaux ioniques, l'endocytose, le routage et les changements de conformation des canaux lors de leur activation, ou encore la variation spécifique des cations Ca2+ et K+ dans l'environnement du pore d'un canal suite à son ouverture. Ces évènements moléculaires ne sont pas mesurables à l'aide des techniques classiques d'analyse des canaux ioniques. La diversité des sondes BRET mises en place permet aujourd'hui d'envisager l'étude multiparamétrique de l'action des ligands dans le temps lors d'une campagne de criblage à haut débit d'analyse. Mieux encore, l'utilisation du BRET permet d'étudier en temps réel sur cellules vivantes le fonctionnement des canaux intracellulaires (comme les canaux lysosomiaux).
Cette thèse vise à préciser la pharmacologie moléculaire de canaux cationiques TRPV1, P2X4 et TRPML1 lorsqu'ils sont exprimés dans le réticulum endoplasmique, sur la membrane mitochondriale (TRPV1), ou sur la membrane lysosomiale (P2X4 et TRPML1). Dans un deuxième temps, à l'aide des différentes sondes BRET utilisées sur chaque canal, nous réaliserons le criblage multiparamétrique à haut débit d'analyse d'une banque de 50,000 composés chimiques issus de la chimiothèque nationale pour trouver de nouveaux ligands ciblant ces canaux ioniques. Ce crible, qui sera réalisé au format 384 puits pour accélérer l'obtention des résultats, demandera à mettre en place une analyse novatrice et automatisée des signatures temporelles générées.

Les canaux ioniques jouent un rôle central dans de nombreux processus physiologiques et pathologiques, notamment dans la neurotransmission, la signalisation calcique, la douleur, l'inflammation et le cancer, ce qui en fait des cibles thérapeutiques majeures. Toutefois, le criblage pharmacologique de ces protéines demeure particulièrement complexe. Les techniques de référence utilisées en recherche académique et industrielle, telles que le patch-clamp ou les sondes fluorescentes, reposent sur des lectures indirectes de l'activité des canaux, sont coûteuses, peu compatibles avec le haut débit ou génèrent un nombre important de faux positifs. Ces limitations sont encore plus marquées pour les canaux ioniques intracellulaires, dont l'étude nécessite souvent des approches invasives ou des systèmes artificiels éloignés des conditions physiologiques.
Dans ce contexte, le développement de sondes BRET génétiquement encodées constitue une avancée majeure, en permettant une mesure directe, non invasive et temporellement résolue de l'activité des canaux ioniques dans des cellules vivantes. Des travaux récents ont démontré la capacité de ces sondes à révéler des propriétés pharmacologiques fines, telles que le biais de ligand ou la modulation de la sélectivité ionique, invisibles avec les approches classiques. En s'appuyant sur ces avancées, cette thèse vise à approfondir la compréhension de la pharmacologie moléculaire de canaux cationiques clés et à exploiter le potentiel du BRET pour réaliser un criblage multiparamétrique à haut débit d'une large chimiothèque. Ce travail s'inscrit ainsi dans un contexte scientifique marqué par un besoin urgent de nouvelles technologies pour explorer la diversité fonctionnelle des canaux ioniques et accélérer la découverte de ligands innovants, tout en conservant une forte pertinence physiologique.

L'approche expérimentale de cette thèse reposera principalement sur l'utilisation de la technique du transfert d'énergie en résonance de bioluminescence (BRET) afin de mesurer, en temps réel et sur cellules vivantes, l'activité fonctionnelle de canaux ioniques et les événements moléculaires qui leur sont associés. Le BRET est une méthode biophysique non invasive basée sur le transfert d'énergie non radiatif entre une enzyme bioluminescente (donneur), telle qu'une luciférase, et une protéine fluorescente (accepteur), lorsque ces deux partenaires sont placés à proximité nanométrique. L'émission de lumière par le donneur, déclenchée par l'ajout de son substrat, permet d'exciter l'accepteur sans illumination externe, limitant ainsi les phénomènes de photoblanchiment et de bruit de fond. Les variations du signal BRET reflètent directement des changements de conformation, d'interactions protéine-protéine, de localisation subcellulaire ou de flux ioniques au voisinage immédiat du canal étudié.
Dans ce projet, des sondes BRET génétiquement encodées seront conçues pour cibler spécifiquement les canaux TRPV1, P2X4 et TRPML1, à la membrane plasmique ou au niveau de compartiments intracellulaires. Ces sondes permettront une analyse multiparamétrique et cinétique de la réponse des canaux à différents ligands, et seront compatibles avec des mesures automatisées en format multi-puits pour des applications de criblage à haut débit.
La construction des vecteurs d'expression nécessaires sera réalisée par clonage modulaire utilisant la technique du Golden Gate, qui repose sur l'utilisation d'enzymes de restriction de type IIS et de ligases permettant l'assemblage directionnel, rapide et efficace de plusieurs fragments d'ADN en une seule étape. Cette stratégie facilitera la génération systématique de différentes configurations de sondes BRET (positions du donneur et de l'accepteur, linkers, signaux de ciblage subcellulaire) et garantira une grande reproductibilité dans la production des constructions. Les sondes validées seront ensuite exprimées dans des lignées cellulaires adaptées, et les signaux BRET seront enregistrés à l'aide de lecteurs de plaques compatibles afin d'analyser les signatures temporelles associées à l'activité des canaux ioniques.