Thèse Conception IA et Évolution Expérimentale de Mini-Protéines pour l'Étude de l'Organisation des Récepteurs Ampa aux Synapses H/F - 33

Établissement : Université de Bordeaux
École doctorale : Sciences de la Vie et de la Santé
Laboratoire de recherche : Institut Interdisciplinaire de Neurosciences
Direction de la thèse : Jonathan ELEGHEERT ORCID 0000000241964813
Début de la thèse : 2026-10-01
Date limite de candidature : 2026-05-20T23:59:59

La transmission excitatrice rapide dans le cerveau repose sur les récepteurs glutamatergiques de type AMPA (AMPAR), dont le nombre, la localisation et la dynamique aux synapses déterminent de manière critique la force et la plasticité synaptiques. Si de nombreux mécanismes intracellulaires contrôlant le trafic des AMPAR sont aujourd'hui bien caractérisés, les interactions moléculaires extracellulaires qui organisent et stabilisent les AMPAR aux synapses restent encore mal comprises, notamment en raison de leur nature faible, transitoire et difficilement accessible par des approches conventionnelles.

Des travaux récents de l'équipe d'accueil (SNIPER) ont permis de résoudre le mécanisme structural par lequel les Pentraxines Neuronales (NP) interagissent avec les AMPAR et induisent leur regroupement aux synapses excitatrices, levant ainsi un verrou technique de longue date. Ces avancées ouvrent la voie à une nouvelle phase de recherche visant au développement d'outils moléculaires capables de cibler, manipuler et visualiser de manière sélective des interfaces NP-AMPAR définies dans des neurones vivants.

L'objectif de cette thèse est de développer et d'utiliser des mini-protéines épitope-spécifiques pour étudier l'organisation et la fonction des AMPAR aux synapses. Le projet combine la conception computationnelle de protéines et l'évolution expérimentale continue, en intégrant la conception in silico de mini-protéines à une optimisation expérimentale par évolution dirigée dans la levure (AHEAD), afin d'obtenir une liaison précise sur épitope, associée à une forte expression et à de bonnes propriétés biophysiques.

Le doctorant participera à la fois aux volets computationnels et expérimentaux du projet. Sur le plan computationnel, il sera formé à la conception et à l'analyse structurale de protéines, et contribuera à la conception, à la sélection et à l'évaluation de mini-protéines candidates. Sur le plan expérimental, il réalisera des clonages moléculaires, des expériences d'affichage sur levure, des sélections par cytométrie en flux (FACS), ainsi que la caractérisation biophysique des ligands optimisés. Les mini-protéines sélectionnées seront transformées en outils fonctionnels, soit comme bloqueurs d'interface pour perturber le regroupement des AMPAR dépendant des NP, soit comme sondes fluorescentes pour l'imagerie en temps réel et en super-résolution (uPAINT/STED) de la mobilité et de l'organisation nanométrique des récepteurs.

Ces outils seront utilisés dans des cultures neuronales afin d'étudier comment le regroupement des AMPAR médié par les NP contrôle la dynamique des récepteurs et la signalisation synaptique. En fonction de l'avancement du projet, des analyses fonctionnelles complémentaires, incluant des enregistrements électrophysiologiques dans des populations neuronales définies, pourront être réalisées. Ce projet de thèse offrira ainsi une formation interdisciplinaire à l'interface de la biologie structurale, de l'ingénierie des protéines et de la neurobiologie cellulaire.

Au final, cette thèse permettra de générer de nouvelles sondes moléculaires pour interroger l'organisation des récepteurs synaptiques, d'apporter des éléments mécanistiques sur le contrôle extracellulaire de la fonction des AMPAR, et de contribuer au développement de méthodologies computationnelles et expérimentales généralisables pour la conception et l'optimisation de ligands protéiques ciblant des interfaces biologiques complexes.

ENGLISH - Scientific context

Fast excitatory synaptic transmission in the brain is primarily mediated by AMPA-type glutamate receptors (AMPARs). The number, positioning and nanoscale organization of AMPARs at synapses are key determinants of synaptic strength, plasticity and circuit function. While extensive work has elucidated intracellular pathways controlling AMPAR trafficking, far less is known about the extracellular molecular mechanisms that anchor, cluster and stabilize AMPARs at synapses.

Neuronal Pentraxins (NPs) are secreted and membrane-associated proteins that play a central role in organizing AMPARs at excitatory synapses by directly binding receptor extracellular domains. However, NP-AMPAR interactions are intrinsically weak and transient, which has long hindered their mechanistic characterization and functional manipulation. As a result, causal tools to selectively probe defined NP-AMPAR interfaces in living neurons have been lacking.

Recent advances in structural biology and protein engineering, including AI-based structure prediction and de novo protein design, now enable the rational targeting of challenging protein-protein interfaces. In parallel, experimental continuous evolution systems provide powerful means to optimize designed binders for expression, stability and precise epitope engagement. Combining these computational and experimental approaches offers a unique opportunity to generate tailor-made molecular probes for synaptic biology.

This PhD project is embedded in this emerging framework and builds on recent structural insights into NP-AMPAR assemblies. By integrating AI-guided protein design with experimental evolution and functional validation, the project aims to develop new molecular tools to dissect the extracellular organization of AMPARs and to uncover fundamental principles governing synaptic receptor clustering and signaling.

ENGLISH - Objectives

The main objective of this PhD project is to develop and apply AI-guided, epitope-defined mini-protein binders to investigate the organization and function of AMPA receptors at excitatory synapses.

Specific objectives are:
1. To participate in the computational design of mini-proteins targeting defined Neuronal Pentraxin-AMPAR interfaces using AI-based structure and interface prediction tools.
2. To experimentally optimize designed mini-proteins by continuous evolution in yeast to improve expression, stability, and on-epitope binding properties.
3. To perform biophysical and structural characterization of optimized binders to validate affinity, specificity, and binding mode.
4. To develop functional mini-protein probes, either as interface blockers or fluorescent imaging tools.
5. To apply these probes in neuronal systems to interrogate NP-dependent AMPAR clustering, dynamics, and synaptic signaling.

Through these objectives, the PhD aims to bridge computational protein design with experimental validation to uncover extracellular mechanisms controlling synaptic receptor organization.

FRANÇAIS - Objectifs

L'objectif principal de cette thèse est de développer et d'utiliser des mini-protéines épitope-spécifiques, conçues à l'aide d'approches guidées par l'IA, afin d'étudier l'organisation et la fonction des récepteurs AMPA aux synapses excitatrices.

Les objectifs spécifiques sont :
1. Participer à la conception computationnelle de mini-protéines ciblant des interfaces définies entre les Pentraxines Neuronales et les AMPAR à l'aide d'outils de prédiction structurale et d'interfaces basés sur l'IA.
2. Optimiser expérimentalement les mini-protéines conçues par évolution continue dans la levure afin d'améliorer leur expression, leur stabilité et leurs propriétés de liaison sur épitope.
3. Réaliser la caractérisation biophysique et structurale des ligands optimisés pour valider leur affinité, leur spécificité et leur mode de liaison.
4. Développer des mini-protéines fonctionnelles, utilisées soit comme bloqueurs d'interface, soit comme sondes fluorescentes pour l'imagerie.
5. Appliquer ces outils dans des systèmes neuronaux afin d'interroger le regroupement, la dynamique et la signalisation synaptique des AMPAR dépendants des NP.

Ces objectifs visent à établir un lien direct entre la conception computationnelle de protéines et leur validation expérimentale, afin de comprendre les mécanismes extracellulaires contrôlant l'organisation des récepteurs synaptiques.

FRANÇAIS - Contexte scientifique

La transmission synaptique excitatrice rapide dans le cerveau est principalement assurée par les récepteurs glutamatergiques de type AMPA (AMPAR). Le nombre, la localisation et l'organisation nanométrique des AMPAR aux synapses déterminent de manière essentielle la force synaptique, la plasticité et le fonctionnement des circuits neuronaux. Si de nombreux travaux ont permis de caractériser les mécanismes intracellulaires régulant le trafic des AMPAR, les mécanismes moléculaires extracellulaires assurant leur ancrage, leur regroupement et leur stabilisation aux synapses restent encore mal compris.

Les Pentraxines Neuronales (NP) sont des protéines sécrétées ou associées à la membrane qui jouent un rôle central dans l'organisation des AMPAR aux synapses excitatrices, en se liant directement aux domaines extracellulaires des récepteurs. Cependant, les interactions NP-AMPAR sont intrinsèquement faibles et transitoires, ce qui a longtemps limité leur caractérisation mécanistique et leur manipulation fonctionnelle. Il en résulte un manque d'outils causaux permettant de cibler sélectivement des interfaces NP-AMPAR définies dans des neurones vivants.

Les avancées récentes en biologie structurale et en ingénierie des protéines, notamment la prédiction de structures et la conception de protéines guidées par l'intelligence artificielle, offrent désormais la possibilité de cibler rationnellement des interfaces protéine-protéine complexes. En parallèle, les systèmes d'évolution expérimentale continue constituent des approches puissantes pour optimiser l'expression, la stabilité et la spécificité de ligands protéiques. La combinaison de ces approches computationnelles et expérimentales ouvre des perspectives inédites pour le développement d'outils moléculaires sur mesure en neurobiologie synaptique.

Ce projet de thèse s'inscrit dans ce contexte émergent et s'appuie sur des avancées structurales récentes concernant les assemblages NP-AMPAR. En intégrant la conception de protéines guidée par l'IA, l'évolution expérimentale et la validation fonctionnelle, il vise à développer de nouveaux outils moléculaires pour disséquer l'organisation extracellulaire des AMPAR et à révéler des principes fondamentaux régissant le regroupement et la signalisation des récepteurs synaptiques.